欄目導讀
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　　斑馬魚胚胎對有毒有害物質(zhì)非常敏感，已經(jīng)成為國際上生物醫(yī)學和環(huán)境毒理學的標準模式生物，廣泛應用于常規(guī)毒性試驗、分子及細胞生態(tài)毒理研究和生物誘導效應檢測等多個方面。

　　
　　圖片來源：攝圖網(wǎng)
　　國際標準組織已將斑馬魚推薦為河水毒性檢測的試驗魚種，并提出了相應的標準方法（ISO 07346)；我國生態(tài)環(huán)境部亦發(fā)布了《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》（ HJ 1069—2019），適用于測定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的急性毒性。斑馬魚飼養(yǎng)容易，利用其胚胎的毒性檢測方法具有節(jié)約空間、費用低等諸多優(yōu)勢，因此，在生態(tài)毒理學研究和水環(huán)境檢測等領域得到了廣泛的應用。
　　在利用斑馬魚胚胎評價環(huán)境污染物毒性時，致死性反應毒理學終點是環(huán)境安全評估的一項重要指標；但是，在自然水生態(tài)系統(tǒng)中，污染物通常具有濃度低、種類多、成分和作用機制復雜等特點，受污染的生物通常表現(xiàn)為畸形、突變等非致死性反應。通過觀測經(jīng)毒性物質(zhì)染毒條件下魚卵胚胎心跳的情況，判斷魚卵胚胎發(fā)育的毒性效應，是評價分析毒性物質(zhì)的一種重要方法，同時，胚胎的心率變化也是相對較早可檢測到的指標。
　　當前，針對斑馬魚胚胎的心率監(jiān)測，多依賴于顯微鏡觀測的計數(shù)方法，準確性受觀測者主觀判斷的影響較大。這種基于斑馬魚胚胎錄制視頻文件、以人工計數(shù)心率的方式具有工作量大、存在誤差等劣勢。此外，當前斑馬魚胚胎心跳觀測普遍采用24孔板染毒，置于顯微鏡觀測并計數(shù)胚胎心跳。在這種觀測環(huán)境下，魚卵胚胎和試驗培養(yǎng)液直接暴露于室內(nèi)空氣中，難以保證較好的觀測條件，同時也會影響試驗的準確性。
　　計算機視覺是使用計算機及相關設備對生物視覺的一種模擬技術(shù)，能夠代替人眼對目標進行識別、跟蹤和測量，并可以進一步對圖形進行處理和分析，在水環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)學研究中逐漸開始得到廣泛應用。針對水質(zhì)毒性試驗和評價的需求,本研究基于計算機視覺技術(shù)，建立了精確檢測斑馬魚心率的自動觀測系統(tǒng)，并進行了初步驗證，旨在提高斑馬魚毒性檢測方法的效率和精度，為水質(zhì)毒性檢測方法提供一種新思路。
　　01材料與方法
　　試驗所用的斑馬魚購自同濟大學長江水環(huán)境教育部重點實驗室，個體長度為4~5cm，飼養(yǎng)于充分曝氣的自來水中，水溫保持在(26±1)℃，pH值控制在 7~8，光照/黑暗周期控制為14h:10h。每日喂食2次（冷凍紅線蟲，購于上海曲陽花鳥市場），并輔助混合干飼料喂食以增加產(chǎn)卵量。斑馬魚飼養(yǎng)3個月以上并達到性成熟后進行試驗，飼養(yǎng)期間活動正常、無死亡。一般，斑馬魚卵胚胎在受精 24h 后(24hpf)心臟發(fā)育成形，即可在顯微鏡下觀測到心跳。
　　試驗前夜，在暗室內(nèi)將產(chǎn)卵器放入魚缸，親魚按1:2雌雄比放入產(chǎn)卵器內(nèi)，中間用隔板隔開，下方放置魚卵收集器,次日清晨抽出隔板，光照30min 以刺激斑馬魚產(chǎn)卵。取出魚卵收集器，用闊口膠頭滴管(管口直徑大于卵徑)將卵吸出，然后用標準稀釋水清洗魚卵數(shù)次，以除去糞便等雜質(zhì),挑選出正常的受精卵培養(yǎng)備用。
　　標準稀釋水配置參照《水質(zhì) 急性毒性的測定斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)的方法進行。
　　02心率觀測系統(tǒng)構(gòu)建
　　2.1心率觀測系統(tǒng)設計
　　心率觀測系統(tǒng)由實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置、組裝的高速攝像顯微鏡和視頻圖像心率識別程序組成。實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。組裝的高速攝像和顯微鏡系統(tǒng)采用高清(1920×1080/50P)攝像機,在 APS-C 商用畫幅下能得到 0.1μm2/Pixel(像素) 的分辨率；顯微鏡采用光學倒置顯微鏡(Olympus CKX41)(圖 2)。
　　
　　圖 1 實驗室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖
　　
　　圖 2 計算機視覺系統(tǒng)裝置
　　2.2胚胎染毒方法
　　在對 Schulte 等的研究方法進行改進的基礎上，采用自主設計加工的卵胚胎培養(yǎng)裝置（圖1）進行染毒試驗。挑選出4枚 24hpf正常受精卵置于培養(yǎng)裝置胚胎放置腔內(nèi)，組裝好培養(yǎng)裝置，利用染毒試液構(gòu)建恒溫水浴環(huán)境對胚胎進行染毒。
　　在室溫與目標溫度相近的情況下，將染毒試液由泵水管與恒溫進水口相連，控制壓力保持胚胎腔室液位穩(wěn)定，不溢出。試驗時，先將位于透光上蓋板內(nèi)壁上的標記黏結(jié)固定合適大小、形狀的纖維團（透光化纖），再將進樣泵一端連接恒溫水源，進樣泵另一端連接進水孔；在進樣泵作用下，恒溫水通過進水孔進水，進入容納單元，充滿側(cè)板與腔室之間及腔室相互之間的空隙以及各個腔室，然后通過出水孔流出。控制水壓，保持腔室水位穩(wěn)定后，通過吸管將卵胚胎放入腔室底部，再鋪上脫脂棉薄層，使魚卵胚胎固定在纖維絮層上，并蓋上已黏結(jié)纖維團的上蓋板，封閉腔室，隨著上蓋板蓋合，纖維團即可插入纖維絮層并填充腔室，之后將該裝置放置于倒置顯微鏡上，通過透光的下底板觀測魚卵胚胎心跳的情況，進行觀察及視頻錄制。室溫與目標溫度相差較大會影響胚胎生理指標，此時，只需將進樣泵水管連接水體恒溫裝置后再與恒溫進水口相連即可。
　　2.3視頻圖像心率識別方法
　　視頻文件由心率識別程序處理后得到胚胎心率指標。心率識別程序采用 Matlab 數(shù)學軟件編寫，通過對基于灰度變化的斑馬魚心室圖像面積的 Matlab程序編碼。編寫的8組M碼文件可以組合應用于Matlab 軟件，對視頻圖像文件不同部分進行黑色和白色處理，最終得到心室面積的實時變化值。心室面積變化值反映了心臟的收縮和擴張，心室面積值-時間曲線的2次波峰之間的時間間隔內(nèi)即發(fā)生了1次完整的心跳。因此，通過對心室面積值-時間曲線的分析即可得到心率，從而實現(xiàn)心室圖像心率識別。
　　03方法驗證實例
　　為觀測正常的斑馬魚胚胎心跳，以日常放置半天的自來水為試驗試劑，通過上述心率檢測系統(tǒng)進行正常環(huán)境下斑馬魚胚胎的觀測、視頻錄制和心率識別，以驗證本研究構(gòu)建的觀測系統(tǒng)的準確性。本例所用視頻文件總時長為6min，心率識別程序每隔0.02s對視頻圖像進行 1 次處理，共得到18000個面積數(shù)據(jù)值。
　　利用 Excel 2013從所得的面積數(shù)據(jù)值中隨機選取5組連續(xù)5s內(nèi)的數(shù)據(jù)值，根據(jù)各面積-時間曲線圖總體趨勢，5組曲線走勢類似，且均可清晰地分辨出波峰數(shù)量，數(shù)據(jù)波峰數(shù)量均為9，隨機抽取的1組心室面積值-時間折線圖如圖3所示。為判斷心率與波峰的對應關系，對心率識別程序所用視頻文件進行人工計數(shù)，同樣采用隨機選取4組1min時長進行計數(shù)，所得結(jié)果分別為112、105、108、114次/min，平均心率為110次/min。1min斑馬魚胚胎平均心跳數(shù)為108次，與人工計數(shù)所得幾乎一致，波峰與心率基本吻合，說明通過構(gòu)建的計算機識別程序可準確計數(shù)斑馬魚胚胎的心率變化。
　　
　　圖 3 隨機抽取的心室面積-時間曲線圖
　　采用混合地表徑流樣品為試驗試劑進行培養(yǎng)，分別用顯微鏡人工觀測和本系統(tǒng)觀測斑馬魚胚胎心率。顯微鏡觀測斑馬魚胚胎發(fā)育48h的心率為(153±13)次/min，本系統(tǒng)觀測的平均值為151次/min，與人工技術(shù)結(jié)果一致，進一步說明了系統(tǒng)觀測的準確性。
　　04方法應用討論
　　在以斑馬魚為受試生物的環(huán)境毒理學研究中，斑馬魚胚胎心率在不同濃度染毒試劑中的變化情況已有廣泛的研究。本研究所提供的斑馬魚心率觀測系統(tǒng)，基于計算機視覺技術(shù)，可隨機選出足夠多組數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)心率結(jié)果誤差最小化。本研究提供的方法可在后續(xù)的研究中構(gòu)建更多的水體污染物濃度與心率關系曲線，實現(xiàn)對水質(zhì)的快速檢測。同時，斑馬魚心率觀測系統(tǒng)能夠更好地模擬自然環(huán)境，可以對卵胚胎發(fā)育全過程進行實時觀測和圖像提取分析，在研究胚胎發(fā)育形態(tài)方面也具有較大優(yōu)勢。在對污染物濃度變化大的降雨徑流水質(zhì)和毒性比較時，Chen等發(fā)現(xiàn)，基于傳統(tǒng)方法的水質(zhì)評價并不能完全反應降雨徑流的生態(tài)毒性水平，應考慮同時進行徑流的毒性和水質(zhì)檢測。本方法可在觀測斑馬魚胚胎毒理學指標的同時，構(gòu)建在線監(jiān)測系統(tǒng)進行水體水質(zhì)監(jiān)測，可實現(xiàn)水質(zhì)指標和生態(tài)毒性指標的協(xié)同在線檢測。
　　05結(jié)語
　　本研究提供了一種斑馬魚心率觀測系統(tǒng)的建立方法，改進了胚胎觀測的條件，能夠更好地模擬斑馬魚胚胎發(fā)育的自然環(huán)境，從而使觀測結(jié)果更加準確；通過編寫的視頻圖像心率識別程序，與傳統(tǒng)人工計數(shù)方式相比，基于計算機視覺的胚胎心率計數(shù)更加高效、快速和準確；斑馬魚心率觀測系統(tǒng)在檢測系統(tǒng)中的應用驗證了系統(tǒng)的可行性和準確性。在具體的水質(zhì)檢測應用中，可以采用斑馬魚卵胚胎在水樣中染毒，構(gòu)建出心率與水質(zhì)變化的規(guī)律，從而通過心率變化實現(xiàn)對水質(zhì)和毒性的實時協(xié)同監(jiān)測。
來源： 凈水技術(shù)