過去十年，我們看到越來越多由于抗生素耐藥性導(dǎo)致病人“無藥可治”的報(bào)道。數(shù)據(jù)顯示，在2007-2015年間，歐洲每年因?yàn)楦腥究股锬退幮圆≡w死亡人數(shù)從1.1萬升至2.7萬。水生環(huán)境在傳播抗藥性方面起著潛在的重要作用。

污水處理廠是維持城市衛(wèi)生健康的重要基礎(chǔ)設(shè)施，但由于大部分的污水廠在設(shè)計(jì)階段沒有考慮抗生素耐藥性的問題，所以這些抗生素耐藥性基因(ARGs)會(huì)和污水廠的出水一起排入河道等水體。那么這些ARGs最后的去向是如何的呢？

瑞士EAWAG和蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院(ETH)等機(jī)構(gòu)聯(lián)合對瑞士的兩條河流進(jìn)行了考察，他們的調(diào)研結(jié)果發(fā)表在IWA期刊《Water Research》上。

視頻：EAWAG研究團(tuán)隊(duì)去野外河流采樣的情景
考察地點(diǎn)概況

Suze河和Murg河是這次研究考察的河流，因?yàn)樗麄儩M足三個(gè)預(yù)定條件：

1.最高的廢水排放/河流流量比；

2.最少的側(cè)流(減少側(cè)流稀釋作用)；

3.直接接收河流到下游下一個(gè)污水廠的距離最長。

兩條河流的地理分布如下圖所示：

圖：SUZE河的采樣點(diǎn)——沿河的采樣點(diǎn)分布圖（上）第一個(gè)污水廠出水口上游的采樣點(diǎn)（下）

圖：Murg河的采樣點(diǎn)，其中S5是Münchwilen污水廠的采樣點(diǎn)

圖：Münchwilen污水廠的采樣口位置，它有一個(gè)側(cè)流，和污水廠出水比約2:8.

他們的采樣條件也有所講究，例如要在非雨天進(jìn)行采樣，要保證采樣前36h內(nèi)采樣點(diǎn)沒有降雨發(fā)生。在低流速的情況下，采樣深度一般小于30cm (兩個(gè)地方的年流速中位數(shù)為2.03和1.63m3/s)。具體三個(gè)采樣點(diǎn)分為河斷面的中間位置以及河兩岸到中線的中間點(diǎn)位置。現(xiàn)場測量參數(shù)包括溫度T、溶解氧DO、電導(dǎo)率、pH值等，水樣裝入5L的消毒瓶后于4°C避光保存(有機(jī)微污染物的樣品在-20℃下存放)，隨后送至實(shí)驗(yàn)室，并在36h內(nèi)進(jìn)行處理及后續(xù)分析。

Suze河的研究范圍長達(dá)23.7km，其中包括污水廠出水口上游10km的河段，下游則設(shè)置了8個(gè)采樣點(diǎn)(從0.5km到13.7km)。他們在2018年進(jìn)行了4次集中采樣，時(shí)間為7月(3次)和11月(1次)。

Murg河的研究范圍為7km，其中有200m的上游區(qū)和6.8km的下游區(qū)，在下游也設(shè)置了8個(gè)采樣點(diǎn)(從0.5km到6.8k m)。他們在此進(jìn)行了3次采樣，時(shí)間為2018年7月（1次）和8月(2次)。

考察內(nèi)容

他們考察的內(nèi)容包括抗生物耐藥性微生物的數(shù)量、16S rRNA基因擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)、化學(xué)指標(biāo)分析(金屬、離子、溶解性有機(jī)碳、溶解性微污染物)、下游稀釋作用的影響。

其中，根據(jù)此前的使用方法和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)給出的耐藥極限，他們用兩種抗生素的組合來考察抗生物耐藥性微生物的水平(R2A瓊脂平板培養(yǎng))，這兩種組合分別為：

1.克拉霉素（4.0 mg/L）和四環(huán)素（16.0 mg/L）（CLR/TET）

2.磺胺甲惡唑（76.0 mg/L），甲氧芐啶（4.0 mg/L）和四環(huán)素（16.0 mg/L）（SMX/TMP/TET），指臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)給出的腸桿菌科耐藥極限，也是我們以前的研究對象之一。

在稀釋作用方面，他們使用鈉離子和4 / 5-甲基苯并三唑，卡馬西平兩種微污染物作為保守跟蹤物。原因是這些物質(zhì)在出水口的濃度遠(yuǎn)高于上游點(diǎn)，而且不會(huì)在河流系統(tǒng)中降解或被吸附。在這個(gè)基礎(chǔ)上，他們建立了一套稀釋參數(shù)的計(jì)算方法：

圖：在物料平衡假設(shè)下，用某污染物的濃度作為標(biāo)記，得到從上游點(diǎn)A到下游點(diǎn)B的稀釋參數(shù)（DP）

污水廠上游及出水口水質(zhì)

分析結(jié)果顯示，污水廠上游的I型整合子和目標(biāo)ARGs的水平都較低，但在Murg河，ermB和I型整合子的水平有所上升。

兩條河上游的大部分微污染物都在檢測限以下，但ARG培養(yǎng)結(jié)果則顯示，可能有來自城市或農(nóng)業(yè)活動(dòng)的間歇性干擾，但研究團(tuán)隊(duì)表示這些異常點(diǎn)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來找出原因。

圖：qPCR得到的污水排放點(diǎn)上下游河水中sul1和intI1的水平（基因拷貝/ mL）

圖：ARG指示基因的異養(yǎng)菌數(shù)培養(yǎng)結(jié)果(左邊為Suze河，右邊為Murg河，上半部為CLR/TET組合，下半部為SMX/TET/TMP組合的結(jié)果)

下游ARG的短程去向

從上圖可以看出，污水廠出水會(huì)帶入相當(dāng)數(shù)量的污染物。其中出水的鈉濃度高出上游1個(gè)數(shù)量級，ARG和intl1的水平高出1-2個(gè)數(shù)量級，微污染物則高出超過2個(gè)數(shù)量級。

另外，為了更廣泛地了解河流抗生素抗藥性組，他們對部分樣品獲得的元基因組的ARG含量進(jìn)行了檢測。他們一共得到了65個(gè)ARG的子類型，其中49個(gè)在上下游樣品中也有測出。毫無疑問，最靠近出水口的采樣點(diǎn)的抗藥性組會(huì)受到污水廠出水水質(zhì)的影響。

但是，這些抗生素抗性指示基因的水平在出水口下游2-2.5km的位置很快就降到和上游一樣的水平。研究團(tuán)隊(duì)指出這背后有包括來自地下水或支流的稀釋水、陽光暴曬或低溫導(dǎo)致細(xì)胞死亡，又或者是細(xì)胞沉淀這幾種可能的原因。

哪個(gè)是主要的原因呢？稀釋參數(shù)的分析顯示，稀釋作用是最主要的原因。因此他們指出在研究ARG的時(shí)候，要仔細(xì)考慮稀釋作用的影響，要以總的排放量而不是濃度作為下游的評估依據(jù)。

Murg河的異常結(jié)果

Murg河下游5.0-6.8km區(qū)間內(nèi)觀察到sul1 和intI1的升高，他們嘗試對此進(jìn)行解釋。他們首先測定了含有sul1的contigs(重疊群)。Sul1基因有高度的活動(dòng)性，而且常常和intl1有關(guān)。實(shí)際上，所有樣品中與intI1相關(guān)的sul1的contigs都是單一類型的同源物；而且因?yàn)樗信c質(zhì)粒相關(guān)的基因(parA)，因此可能和質(zhì)粒有關(guān)。

研究團(tuán)隊(duì)表示，在這次試驗(yàn)里，他們無法從這些序列信息得到有意義的分類，因此無法確定Murg下游出現(xiàn)的增量是來自污水廠出水中的生物體還是下游環(huán)境生物本身的貢獻(xiàn)，抑或是采樣點(diǎn)附近的本地污染源。他們認(rèn)為在之后的研究中，可以嘗試通過分離或構(gòu)建基因組來獲得更多信息。

除了生物方法，研究團(tuán)隊(duì)還嘗試用化學(xué)指示因子來研究是否存在本地污染源或非點(diǎn)源污染。他們先研究一些在瑞士出現(xiàn)的微污染物作為潛在指示物的可能性，包括用于養(yǎng)豬的磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine或sulfadimidine），以及用作除草劑的mecoprop(2-甲-4-氯丙酸)。

他們認(rèn)為，如果有足夠的農(nóng)業(yè)或城市地表徑流，可能會(huì)攜帶該地區(qū)潛在的抗性基因和細(xì)菌，導(dǎo)致污水廠下游區(qū)域這些污染物濃度水平的增加或持續(xù)偏高。在Suze河中，除一個(gè)上游的樣品之外，所有樣品中的磺胺二甲嘧啶均低于檢出限（LOD約0.8 ng/L）；而在Murg河中，第三次的采樣數(shù)據(jù)顯示，污水廠似乎是磺胺二甲嘧啶的來源之一，然而，在下游的位置又未觀察到該化合物的增加。因此，他們對第三次的樣品進(jìn)行了進(jìn)一步考察，以評估水體原位抗性選擇的潛力。磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole）及其衍生物是所檢出的抗生素中濃度最高的一個(gè)（33-95ng/L），但依然遠(yuǎn)低于預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC)的標(biāo)準(zhǔn)濃度(16000ng/L)。而常與磺胺甲惡唑搭配的抗生素甲氧芐啶(trimethoprim)的測出濃度值也遠(yuǎn)低于PNEC標(biāo)準(zhǔn)值。他們還注意到兩條河的河水停留時(shí)間都相當(dāng)?shù)亩蹋謩e為51.4和49.5min/km，他們認(rèn)為這樣的流速使原位抗性選擇的可能性變得更不合理。

盡管無法為Murg河的異常數(shù)據(jù)找到合理的解釋，他們認(rèn)為觀察結(jié)果清楚地表明，ARGs的增加有可能不是人為污染產(chǎn)生的。他們指出，由于目前sul1和intI1是常用的監(jiān)測人為耐藥性來源的跟蹤基因，因此，他們提醒同行，日后在制定監(jiān)測方案的時(shí)候，應(yīng)該采用多目標(biāo)的方法以增強(qiáng)監(jiān)測的穩(wěn)固性。

小結(jié)

雖然在部分異常數(shù)據(jù)上作者們暫時(shí)無法給出合理地解釋，但無論如何，他們這次研究還是得到了一些積極的新發(fā)現(xiàn)，例如一些很有希望作為日后監(jiān)測人為耐藥性來源的靶標(biāo)基因。這些工具應(yīng)該會(huì)在公共衛(wèi)生方面發(fā)揮更大的作用。

早在2001年，瑞士就推出了全國性的“國家抗藥性研究計(jì)劃”（NRP 49）。這個(gè)五年計(jì)劃旨在建立適用于前瞻性耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)的科學(xué)策略和新方法，并對瑞士所有相關(guān)領(lǐng)域中有關(guān)耐藥性的現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，包括人類以及動(dòng)物種群、農(nóng)業(yè)、食品和環(huán)境等方面。這次研究是在時(shí)隔10年之后，于2016年啟動(dòng)的一次新的全國性研究（NRP 72），目標(biāo)已經(jīng)變?yōu)榻档涂咕啬退幮裕p少其對傳染病治療的負(fù)面影響。兩個(gè)研究項(xiàng)目的總資金分別為1200萬和2000萬瑞士法郎。想了解該項(xiàng)目更多詳情的讀者，可以查閱他們的官網(wǎng)：http://www.nfp72.ch/en

圖：NRP72計(jì)劃時(shí)間表

環(huán)境ARGs研究一直是IWA的關(guān)注焦點(diǎn)，對這方面感興趣的同行，也可以瀏覽香港大學(xué)張彤教授團(tuán)隊(duì)在去年的《Water Research》發(fā)表的相關(guān)綜述文章，題目為《Source tracking of antibiotic resistance genes in the environment — Challenges, progress, and prospects》。

參考資料

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0043135421002487

https://link.springer.com/article/10.1007/s00253-008-1829-z

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0043135420306643

http://www.nfp72.ch/en

https://www.youtube.com/watch?v=0sE7sgwOL7M

https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/109324454